基因编辑技术(延伸:深度了解基因检测技术与基因编辑技术)

基因编辑技术
前面深度报道了3000万天价神药(针对脊髓性肌萎缩症 Spinal Muscular Atrophy的基因疗法AVXS-101)背后价格昂贵的原因,而其同时,也是人类基因疗法历史上的又一个重大突破,具有里程碑式的意义。

关于基因疗法,它包括出生前的胚胎基因选择,以及出生后通过基因编辑技术等手段纠正缺陷。一个是先天避免缺陷胎儿诞生,一个是后天纠正缺陷、治疗疾病。而关于胚胎的基因选择,就离不开基因检测技术。也就是说,基因检测负责发现缺陷,基因编辑负责纠正缺陷、治疗疾病。

基因检测技术

基因检测是通过分子生物学和分子遗传学的手段,检测出DNA分子结构水平或蛋白表达水平是否异常,分析各种疾病预警基因的情况,从而使人们能及时了解自己患某种疾病风险的概率,及时采取应对手段,达到防患于未然的目的。基因检测能早期评估患病风险,指导个性化用药以及个性化精准医疗方案的制定。

基因检测作为一项革命性的新型医疗技术,得益于人类基因组计划(1990-2003)的成功开展。进入21世纪,随着高通量测序技术和设备的发展,逐渐成熟并产业化,而近年来的进展则尤其引人注目。目前最新型的基因测序设备NovaSeq 6000已经可以实现2天内测完整个人的全部基因信息(30亿碱基单位),而且整体费用在1千美元以内!对比人类基因组计划花费10年多时间并投入30亿美元的事实,堪称指数级的价格下降!

成就令人振奋!按照当前的发展速度,我们将很快实现人人基因组测序,届时每个人都能够获知自己全部的基因秘密,实现主动预防疾病,指导健康生活,人类的健康状况将因此达到历史最高水平,实现百岁以上的平均寿命!

基因检测的发展历程

从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法),发展至今三十多年时间,测序技术已取得了相当大的发展,从第一代到第三代,测序读长从长到短,再从短到长。测序技术的每一次变革,都是对基因组研究,疾病医疗研究,药物研发等领域的巨大推动作用。

第一代测序技术,主要基于 Sanger双脱氧终止法的测序原理,结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化,基本方法是链终止或降解法,人类基因组计划就是基于一代测序技术。第一代的Sanger测序技术的优点是,测序读长长,能达到800-1K bp,且测序用时短,只需要几十分钟即可完成一次测序,测序准确度高准确性高达99.999%,目前仍是测序的金标准;缺点是通量低、成本高,影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进,第二代测序技术诞生了。

第二代测序技术的代表是高通量测序技术(NGS),自2005年的第一台基于焦磷酸测序二代测序仪开始,到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列,经历了十几年的技术发展过程,也经历了一系列的收购和合并,最终形成三家主要的测序平台,包括:Solexa平台、Ion Torrent平台和Complete Genomics平台。高通量测序技术经历了十几年的飞速发展,人类基因组测序成本已经从人类基因组计划的约30亿美元降到了1000美元左右。目前二代测序设备在通量、准确度上都有了较大的提高,同时测序成本也随之大幅度下降,成为商用测序的主流。

第三代测序技术的代表是Heliscope单分子测序仪、SMRT技术和纳米孔单分子技术,被认为是测序技术在近两年中新的里程碑。与前两代技术相比,他们最大的特点是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增,其中,Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序,而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备,但在准确度上较二代设备差,目前尚未完全成熟,市场应用面还不算广,未来随着技术的改善,三代测序设备将更为稳定和成熟。

三代测序和二代测序相比较,第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降,通量大大提升,但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率,并且具有系统偏向性,同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的,它的根本特点是单分子测序,不需要任何PCR的过程,这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误,三代读长超长,准确低,费用高,但因读长长,利于组装和发现unique reads潜在优势明显,但是劣势也限制了三代测序的商业应用。

基因编辑技术

基因编辑技术是指特异性改变目标基因序列的技术。其发展是指数式的增长。在几年的时间里,已经有了百万倍的改善。基因编辑具有类似“手术刀”的潜力,可以从根本上治疗从癌症到罕见遗传病的大量疾病。基因编辑技术代表了药物研发的新纪元。

治疗性基因编辑研究的指数级增长得益于近30年来基因治疗的基础研究突破。30年前,第一次基因编辑是在酵母细胞实验中完成。直到过去几年,CRISPR-Cas9技术的出现,使得基因编辑技术有了突飞猛进的发展。2015年,CRISPR-Cas9被《科学》杂志评选为2015年度的突破技术。由于简单性和低成本,它目前是最受欢迎的基因编辑技术,广受学术科学家,投资者,企业家,生物制药业内人士以及公众之间的拥趸。

需要强调的是,基因组编辑(特别是CRISPR-Cas核酸酶)仍处于其实验和临床初期阶段,仍存在一些潜在的可行性和安全性问题,可能会影响临床应用,这问题将需要进一步的临床前研究、适当的模型和精心设计的临床试验来一一克服。

虽然基因编辑最初的重点主要针对罕见的遗传性疾病,但它其实具有更加广泛的应用。它可以用于攻击传染人类的病毒,或者通过修改蚊子等生物的基因来预防传染疾病(如疟疾)的传播。

小知识:目前主要的基因编辑技术都是在细胞内利用外源切割复合体特异性识别并切割目的基因序列,在目的基因序列上制造断裂端,这种断裂端随即会被细胞内部的DNA损伤修复系统修复,重新连接起来。在此修复过程中,当有修复模板存在时,细胞会以修复模板为标准进行修复,从而实现对基因序列的特异性改变,即基因编辑。

基因编辑技术研究历程也并非一帆风顺

自1953年沃森和克里克两位科学家提出DNA的双螺旋结构以来,人们一直都在积极探索着高效便利的基因编辑技术。

上世纪80年代,科学家在小鼠胚胎干细胞中通过基因打靶技术实现了基因编辑(2007年诺贝尔生理医学奖),但此技术在其余细胞内效率极低,应用受到了极大的限制;

上世纪90年代,基于细胞内不同锌指蛋白可特异性识别DNA上3联碱基的特征以及核酸酶FokI二聚化后可以切割DNA的特点,人们通过锌指蛋白偶联Fokl的策略逐渐发展出了一种新的基因编辑技术–锌指蛋白核酸酶技术(Zinc Finger Nucleases, ZFNs)。但此技术专利被公司垄断,且锌指蛋白数量有限,可以识别的DNA序列数量有限,其应用也受到了很大的限制。

20世纪90年代后期和21世纪初,研究人员使用g-逆转录病毒载体对T细胞进行基因编辑,引起编码白细胞介素-2受体或腺苷脱氨酶的基因的功能丧失,结果显示重症联合免疫缺陷(SCID)患者的免疫功能明显改善。尽管g-逆转录病毒载体的HSC转导效率相对较低,但基因修饰的T细胞依旧能够扩增并填充T细胞区室。慢病毒载体获得的HSC的高转导效率使得基因治疗方法更广泛地应用于血液疾病和肿瘤的治疗。

2009年的实证表明,细菌蛋白质的转录激活剂样效应子(TALEs)很容易被改变,从而为TALE核酸酶(TALENs)的创造打开了大门。这些酶可以有效地切割任何DNA序列。然而,TALEN法仍需为每个DNA设计一对特定的核酸酶。

2012年,基因组编辑格局发生了变化。Doudna和Char-pentier发现CRISPR-Cas9核酸酶组成的细菌防御系统可以通过设计与目标位点互补的特定短指导RNA(gRNA)来切割DNA。CRISPR-Cas9核酸酶技术迅速应用到哺乳动物细胞中,从而简化了编辑过程。TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶实现了快速重新编程,现在广泛用于基础研究中。基因组编辑技术为修正或改变基因组提供了精确的解剖刀,并且克服了依靠病毒载体介导的半随机基因组插入的缺点。

基因组编辑进入临床的步伐越来越快。工程化的锌指核酸酶(ZFNs)已被用于破坏人类T细胞和HSCs中的CCR5(C-C基序趋化因子受体5型)的表达,帮助这些细胞抵抗HIV感染。TALEN已被用于制造可防止移植物抗宿主病(GVHD)的CAR-T细胞。

此外,在急性骨髓性白血病和浆细胞样树突状细胞肿瘤中,TALEN编辑的CAR -T细胞的早期试验已经开始。同时,美国食品和药物管理局(FDA)已批准启动三项ZFN介导的治疗性基因体内插入肝细胞白蛋白基因座的临床试验,目的是为血友病B患者提供IX、aL 基因,并为II型粘多糖病(MPS II)患者提供艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因。体内基因组编辑治疗的第一位参与者已经参加了MPS II试验,通过AAV静脉输注,实现肝脏基因组的精准编辑。

过去的一年中,基因组编辑方面的进展一度突飞猛进,来自多个临床试验的成熟数据的发表显示了各种严重人类疾病的基因疫苗的有效性和安全性。在政府和慈善机构的支持下,从事基础研究和临床研究的科学家与临床医生将继续创新并提供新的或改进的技术。但目前仍然存在许多挑战,例如通过整合基因递送载体或脱靶基因组编辑来处理基因毒性,将基因转移或编辑效率提高到能够有效治疗疾病的水平,解决重复体内施用载体引起的免疫应答,就有关争议的问题达成社会共识等等。

常笑健康提醒

基因检测技术可以发现基因的缺陷,基因编辑技术可以纠正缺陷,治疗疾病。基因检测的价格已经远远不是当初30亿美元的天价,而是降到了1000 美元以内,而且,未来还会继续下降;基因编辑技术近几年也已经有了百万倍的改善,虽然还有很多挑战需要一一克服,但相信,在未来,基因编辑技术不仅会成为治疗罕见遗传病的希望,而且随着商业化发展,价格一定会降到普通老百姓能够接受的水平,应用范围也会更加广泛。





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